角质细胞生长因子及氯化锂诱导毛囊干细胞定向分化中的信号通路

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.018

摘要/Abstract

摘要：

背景：毛囊干细胞的增殖分化受到自身基因及外来信号的共同作用，Wnt/β-catenin信号通路在毛囊毛发发育中起重要作用，但详细机制尚未明确。
目的：探讨在角质细胞生长因子及氯化锂干预下，Wnt/β-catenin信号通路在人毛囊干细胞向毛囊乳突细胞或表皮细胞定向分化中的作用及与其他信号分子的相互关系。
方法：获取毛囊隆突区干细胞进行培养，检测其生长曲线，观察1×10⁶ L^-1、1×10⁷ L^-1、1×10⁸ L^-1和1×10⁹ L^-1培养的毛囊干细胞在不同时间点的增殖效应；使用免疫荧光染色法对毛囊干细胞及其分化细胞进行鉴定。分别以0，0.5，1.5，10，25 mmol/L氯化锂及0，10，25，50，100 μg/L角质细胞生长因子诱导毛囊干细胞分化，对比各组细胞的增殖效应，探索促毛囊干细胞分化的最佳氯化锂及角质细胞生长因子浓度。使用RT-PCR检测未处理对照组、10 mmol/L氯化锂组和10 μg/L角质细胞生长因子组干预后3，5，7，9 d细胞的β-catenin、APC、GSK-3β、Axin和Lef1的mRNA转录水平。
结果与结论：分离培养的毛囊干细胞在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能，随氯化锂浓度升高，细胞增殖效应减弱；而随角质细胞生长因子组质量浓度增高细胞增殖能力增强。含有氯化锂的K-SFM条件培养基中毛囊干细胞形态改变明显，各组间有明显差别，氯化锂>10 mmol/L时分化比例高，β-catenin表达量增高；而含有角质细胞生长因子K-SFM条件培养基中毛囊干细胞向表皮细胞分化，β-catenin变化不明显。提示氯化锂在促毛囊干细胞分化中，激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制降解复合物重要成分GSK-3β的表达下降，促使β-catenin在细胞浆表达增加并转入核内，增加靶基因转录，促使毛囊干细胞向毛囊细胞方向分化。氯化锂>10 mmol/L是促毛囊干细胞分化的最佳浓度，但增殖效应减弱。角质细胞生长因子可促进毛囊干细胞向表皮分化，可促进毛囊干细胞增殖和迁移，促进创面再上皮化及创面愈合。氯化锂和角质细胞生长因子促毛囊干细胞定向分化的作用机制可能为激活Wnt/β-catenin信号通路，促使β-catenin表达改变，从而激活Wnt信号通路中Lef介导相关靶基因的转录。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 诱导, 毛囊干细胞, 氯化锂, 角质细胞生长因子, Wnt/β-catenin信号通路, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The proliferation and differentiation of hair-follicle-generating stem cells are influenced by the joint action of their own genes and external signals. Wnt/β-catenin signaling pathway plays an important role in the development of hair follicles, but the detailed mechanisms are not yet clear.
OBJECTIVE: To investigate, with interruption of keratinocyte growth factor and lithium chloride, the function and the interrelationship of Wnt/β-catenin signaling pathway with other signal factors when human hair-follicle-generating stem cells differentiate into dermal papilla cells or epidermal cells.
METHODS: Hair-follicle-generating stem cells were isolated from the bulge and cultivated. Then the growth curve of hair-follicle-generating stem cells was tested and formed in order to observe the cell proliferation ability cultivated at different densities (1×10⁶/L, 1×10⁷/L, 1×10⁸/L, 1×10⁹/L) at each time. Immunoflurorescene staining was performed to identify hair-follicle-generating stem cells and their differentiated cells. Lithium chloride (0, 0.5, 1.5, 10, 25 mmol/L individually) and keratinocyte growth factor (0, 10, 25, 50, 100 μg/L individually) were used to induce the differentiation of hair-follicle-generating stem cells. Then, we contrasted and analyzed the proliferation ability in each case, thereby investigating the most appropriate concentration of keratinocyte growth factor and lithium chloride to spur the differentiation of hair-follicle-generating stem cells. At days 3, 5, 7 and 9, we tested and compared the mRNA expressions of β-catenin, APC, GSK-3β, Axin and Lef1 from cells in control group, 10 mmol/L lithium chloride group and 10 μg/L keratinocyte growth factor group.
RESULTS AND CONCLUSION: Isolating cultured hair-follicle-generating stem cells still had a great reproductive activity and multi-lineage potential even after various times subculture in vitro. With higher lithium chloride concentration, the proliferation ability of hair-follicle-generating stem cells declined; while it increased when keratinocyte growth factor concentration increased. In K-SFM medium which contained lithium chloride, the transformation of hair-follicle-generating stem cells was obvious, showing distinct differences among groups. Especially, the level of β-catenin reached the peak when lithium chloride > 10 mmol/L. However, in K-SFM medium which contained keratinocyte growth factor, hair-follicle-generating stem cells differentiated into epidermal cells and the level of β-catenin changed slightly. We found that, while spurring the differentiation of hair-follicle-generating stem cells, lithium chloride could activate Wnt/β-catenin signal pathway and inhibit GSK-3β, a vital component of degradation compound. This facilitated β-catenin expressing in the cytoplasm to translocate into the nucleus. As a result, the transcription of target gene increased. It is the most appropriate concentration to spur hair-follicle-generating stem cells differentiation when lithium chloride level is > 10 mmol/L, but the proliferation ability declines correspondingly. Keratinocyte growth factor, which can facilitate hair-follicle-generating stem cells differentiated into epidermal cells, is a key factor to accelerate proliferation ability and migration of hair-follicle-generating stem cells, re-epithelialization and healing of wound. The mechanisms of hair-follicle-generating stem cells oriented differentiation induced by lithium chloride and keratinocyte growth factor are activating Wnt/β-catenin signal pathway, inducing change of β-catenin expression, and activating the transcription of target gene related to Wnt/β-catenin signaling pathway.

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Key words: stem cells, hair follicle, lithium chloride, Wnt proteins

中图分类号:

R394.2

杨斌，邓立欢，李秉航，吴小莹，丁榆德，董雪. 角质细胞生长因子及氯化锂诱导毛囊干细胞定向分化中的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(19): 3060-3068.

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图/表（结果） 12

2.1 人毛囊干细胞一般生长情况

细胞生长情况：来自人头皮毛囊隆突区的原代细胞为圆球形，细胞体积小且均匀，活细胞透光性良好，细胞边界清晰，也可见多个细胞组成的细胞团，为未解离细胞；锥虫蓝染色活细胞计数，接种的活细胞比例大于95%。在培养初期，细胞贴壁能力较差，活性较低。在含表皮细胞生长因子的无血清培养液K-SFM中生长1-3 d观察发现，人毛囊干细胞只有少量细胞贴壁，大部分细胞呈悬浮状态。培养4-6 d时，开始有少数细胞或细胞团开始贴壁生长，贴壁细胞呈椭圆形或铺路石状生长，折光性好，排列紧密。随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。培养大约2周后，部分细胞有老化表征(图1)。

细胞生长动力学检测：细胞接种的最初1-3 d，细胞生长缓慢；在第4-6天开始，细胞增殖较快，进入细胞增殖期。约2周后，细胞生长变缓，老化细胞开始出现(图2)。按照1×10⁶ L^-¹、1×10⁷ L^-¹、1×10⁸ L^-¹和1×10⁹ L^-¹的细胞浓度接种，发现1×10⁶ L^-¹、1×10⁷ L^-¹时，少量细胞可呈零星克隆生长，但细胞数量少，增殖能力低下，不久后变出现死亡。接种浓度为1×10⁸ L^-¹时，早期便可呈细胞团贴壁生长，增殖活跃，细胞活性良好。以1×10⁹ L^-¹浓度接种时，细胞很快呈团生长，培养液的营养物质消耗快，且出现接触性抑制生长，细胞容易老化(图3，4)。

2.2 人毛囊干细胞的鉴定

Pan-Cytokeratin免疫荧光染色鉴定：贴壁毛囊干细胞在蓝光下观察，其FITC标记的泛角蛋白阳性细胞胞浆均呈绿色染色(图5A)。

K19-Cy3免疫荧光染色鉴定：分离得到的毛囊干细胞群绿光下观察，可见部分K19阳性细胞胞浆呈红色染色(图5B)。

β1-integrin免疫荧光染色鉴定：在蓝色光观察下，胞浆呈绿色β1-integrin染色阳性，毛囊干细胞阳性率较高，阳性细胞呈团生长(图5C)。

2.3 氯化锂对人毛囊干细胞增殖的影响 诱导剂氯化锂处理后毛囊干细胞增殖能力较未处理对照组未见明显增殖，随着氯化锂浓度的升高，其剂量与增殖能力呈负相关(图6，7)。同时也观察到浓度在10 mmol/L以内，细胞增殖能力未见明显减弱，特别是在培养时间<72 h，0-10 mmol/L剂量的氯化锂差异无显著性意义(P > 0.05)。但当浓度达到 25 mmol/L时，细胞增殖能力明显下降，25 mmol/L组与对照组(0 mmol/L)在各时间段对比差异有显著性意义(P < 0.05-0.01)。

2.4 角质细胞生长因子对毛囊干细胞增殖的影响 细胞生长因子角质细胞生长因子处理后毛囊干细胞增殖能力增强，随着角质细胞生长因子质量浓度的升高，其剂量与增殖能力正相关(图8，9)。结果发现角质细胞生长因子质量浓度在50 μg/L以内细胞增殖能力好。与此同时，过高的角质细胞生长因子浓度在早期增殖明显，晚期却表现为细胞过早死亡。当角质细胞生长因子质量浓度控制在10-25 μg/L时，细胞即表现出良好的增殖效果，晚期也保持良好的活性而未出现过早的老化现象。

2.5 氯化锂/角质细胞生长因子对人毛囊干细胞增殖分化的影响 10 mmol/L氯化锂及10 μg/L角质细胞生长因子处理后与对照组(图10A-D)对比，细胞形态、细胞黏附及增殖能力有所改变。氯化锂组较对照组未见明显增强，其细胞胞浆、胞核变大变圆 (图10E-H)。同时到观察角质细胞生长因子组增殖明显，表现出剂量依赖性，后期细胞老化，增殖能力反而下降，也出现大泡的细胞(图10I-L)。

2.6 氯化锂对人毛囊干细胞Wnt信号mRNA水平的影响 毛囊干细胞在10 mmol/L的诱导剂氯化锂的处理下，β-catenin的mRNA相对表达量升高，随着β-catenin水平升高的mRNA片段有APC和LEF1。而Axin和GSK-3的表达却逐渐减少(图11)。

2.7 角质细胞生长因子对人毛囊干细胞Wnt信号mRNA水平的影响 毛囊干细胞在10 μg/L角质细胞生长因子的处理下，β-catenin mRNA相对表达量没有明显改变，GSK-3β水平有减弱的趋势，而LEF1表达逐渐减少(图12)。

参考文献

引言

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2010年1月至2013年12月在中国医学科学院整形外科医院整形外科研究所科研中心完成。

材料：新鲜人头皮标本，来源于中国医学科学院整形外科医院除皱患者切除的多余头皮。

方法：

取材及细胞分离：无菌条件下取新鲜头皮标本，按文献[1]的方法进行毛囊干细胞的分离。

毛囊干细胞获取及培养^[1]：将手术后获取的人头皮组织用含有5%青-链霉素(Costar)的PBS反复冲洗，并剪除皮下脂肪组织，去除杂质及游离毛发，剪成4 mm×2 mm条状大小，置于盛有0.25%Dispase的离心管中，4 ℃消化过夜。16-18 h后顺着毛发生长方向轻轻拔出毛囊，PBS清洗直至去除离散的皮下油脂，移入60 mm培养皿中，添加体积分数10%胎牛血清DMEM培养基，在手术显微镜下切取毛囊隆突区，收集移入离心管中，加入 2.5 g/L胰蛋白酶/0.04%EDTA于37 ℃消化10 min，终止消化去除毛囊后离心，加K-SFM重悬、计数，以5×10⁷ L^-¹细胞浓度接种于培养皿中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱中培养，每三至四天换液1次。冻存及融化，传代培养至第3代。

毛囊干细胞不同细胞浓度的增殖差异：按照1×10⁶L^-¹，1×10⁷ L^-¹，1×10⁸ L^-¹和1×10^{9^-¹的细胞浓度接种培养第3代毛囊干细胞。} L

细胞生长动力学检测：对第3代细胞进行生长曲线测定。取对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度为1×10⁸ L^-¹，接种24孔板，每孔接种1 mL，分12组，每组3孔，共36孔。采用Hoechst33258 DNA定量法测定。

免疫细胞化学：将已消毒好的盖玻片置于60 mm培养皿中，按2×10⁷ L^-¹的细胞浓度将第3代细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，待细胞长出后，进行Pan、　褷Cytokeratin、K19-Cy3、β1-integrin免疫细胞组织化学染色鉴定。

不同浓度氯化锂/角质细胞生长因子对毛囊干细胞增殖影响：取第3代毛囊干细胞，分别选用以0，0.5，1.5，10，25 mmol/L的氯化锂及0，10，25，50，100 μg/L浓度梯度的角质细胞生长因子诱导毛囊干细胞分化, 用Hoechst方法检测对比分析各组不同培养时间对细胞增殖的效应。

RT-PCR检测Wnt信号通路中各基因表达：

RT-PCR检测10 mmol/L的氯化锂干预下，不同时间点各组细胞β-catenin、APC、Axin、GSK-3β、LEF1的mRNA水平：取第3代毛囊干细胞，用无胎牛血清的K-SFM条件培养基制成悬液，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-¹，接种至100 mm的培养皿，各皿加入氯化锂，调整终浓度为10 mmol/L，分别在第3，5，7，9天进行RT-PCR检测各指标mRNA水平，对照组不加氯化锂。

RT-PCR检测10 μg/L的角质细胞生长因子干预下，分别在第3，5，7，9天进行RT-PCR检测各因素mRNA水平，对照组不加角质细胞生长因子。检测方法如下：

总RNA提取：按TRIZOL说明书提取细胞中的总RNA。

反转录：分别取1 μg模版RNA，1 μg Oligo(dT)15及无RNA酶水补足5 μL，混匀后于70 ℃孵育5 min，迅速放入冰浴中5 min，随后在反应体系中加入：无RNA酶水13.5 μL，5×RT Buffer 4 μL，dNTP 1 μL，RNA inhibition 1 μL，MMLV Rnase 1 μL，总体积为25 μL，36 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，最后70 min反应10 min，冰上冷却，保存。

引物的设计与合成：根据目的基因序列设计引物，为了避免基因组DNA的污染，上下游引物均设计为跨过内含子(表1)。

PCR反应体系如下，用无核酸酶水补足体系至20 μL。模板RNA 1 μL，MgCl₂(25 mmol/L) 1.5 μL，5×PCR buffer 4 μL，dNTP Mixture 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq酶0.5 μL，无RNA酶水9.5 μL，总体积20 μL。反应条件如下：94 ℃变性3 min，随即以94 ℃裂解45 s、退火 56 ℃、72 ℃延伸1 min进行35个循环，72 ℃延伸5 min后，4 ℃保存。引物及退火温度见表1，观察电泳结果。引物由上海生物工程有限公司合成并经质量检测，开盖前瞬时离心，加入ddH₂O稀释至浓度为100 μmol/L，-20 ℃储存备用。

主要观察指标：分离培养的毛囊干细胞、不同分化阶段的细胞、在不同的分化阶段Wnt信号通路中β-catenin、APC、GSK3、Axin、Lef1等的表达。

统计学分析：由第三、四、五、六作者进行统计学处理，采用SPSS 10.0统计学软件对数据进行分析和检验。以P < 0.05表示差异有显著性意义，P < 0.01表示差异有非常显著性意义。

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讨论

毛囊干细胞的分化受到多种因素共同调控，这些因素相互作用，构成了复杂的调控系统。影响毛囊干细胞增殖分化的内源性调控因素主要有Wnt、骨形态发生蛋白、Notch和EDA信号通路等^[2]。而外来信号主要包括有丝分裂原、胞间作用、细胞生长因子(碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子等)及一些化学物质(如氯化锂)等，这些外来信号构成了毛囊干细胞增殖分化的外部微环境。角质细胞生长因子是成纤维细胞生长因子超家族的一员，可以调节多种细胞的增殖及分化，当皮肤损伤时，基质细胞角质细胞生长因子的表达明显上调^[3]。角质细胞生长因子对毛囊干细胞细胞的增殖也有很强的促进作用。本实验将隆突区分离培养获得的毛囊干细胞进行体外诱导，探索不同浓度的氯化锂以及角质细胞生长因子在毛囊干细胞增殖和分化过程中的作用，寻找促进毛囊干细胞分化的最佳氯化锂和角质细胞生长因子浓度。

氯化锂可抑制GSK-3β活性，是Wnt信号途径中重要的激动剂^[4]。其机制是通过磷酸化GSK-3pser-9位点使其失去降解β-catenin的能力，从而引起细胞内β-catenin表达水平升高(β-catenin在核内聚集，调节细胞核内转录因子及相关基因，影响毛囊干细胞增殖和定向分化)^[5]。本实验中除了发现Li可以提高细胞内β-catenin表达水平外，作者还发现，低浓度的Li对毛囊干细胞具有微弱的促增殖作用，随着Li浓度的升高，细胞增殖力反而变弱。同时氯化锂作用下细胞表现出黏附力降低。显微镜下观察可见氯化锂能使毛囊干细胞呈分散的团簇生长，促进干细胞的离散性生长。这是Li降低了胞内E-cadherin表达从而降低细胞黏附力，促进细胞迁移^[6]。该现象可能是β-catenin表达增加而引起细胞内E-cadherin转位的结果。说明β-catenin的变化改变细胞黏附，作为信号分子促进细胞增殖的重要途径之一。

在研究中发现 β-catenin的表达与β-catenin-Axin- APC-GSK3β复合体APC 成正相关，与GSK3β及Axin呈负相关。其中，Axin是Wnt信号途径中重要的负性调控因子，是β-catenin降解复合体的关键成分之一，具有多个蛋白-蛋白相互作用区域，在复合体内起支架蛋白的作用，作为多种蛋白复合体的构建基础。Axin使GSK3β接近β-catenin并对其磷酸化降解，实验观察到氯化锂抑制GSK3β活性，使Axin参与的复合体难以形成，间接提高了β-catenin水平。

LEF1是Wnt信号通路下游的转录因子，激活特异性基因的转录。研究发现内源性的LEF1于Wnt信号具有协同作用，目前普遍认为β-catenin发挥功能需与LEF1相结合形成复合体才能启动下游靶基因的活性，辅助子ALY、增强子TCRα与LEF1协同形成高度一致的核蛋白复合体，使β-catenin与LEF1产生相互协同作用，增强转录活性^[7]。本实验结果发现氯化锂激动剂激动时，β-catenin与LEF1水平随诱导时间的延长呈上升趋势。细胞上升的β-catenin水平通过与LEF1结合形成复合体，来发挥功能活性，这个结果与Wnt信号途径的作用机制相一致。说明毛囊干细胞分化涉及到β-catenin和LEF1信号途径的启动。

众多研究已经明确在Wnt信号通路中，β-catenin通过与LEF1相结合发挥作用。Zhu等^[8]利用反转录病毒转染角朊细胞发现，当转基因小鼠表皮基底层表达截断的LEF1时,其无法与β-catenin结合，毛发形成被终止，成体表皮基底细胞向多能胚胎样外胚层转变。LEF1本身是毛囊正常发育所必需的转录因子，其表达使干细胞向毛发方向发展，促进毛母质细胞分化，促进毛囊的分化，并参与毛囊内根鞘形成。

为了进一步了解β-catenin在毛囊干细胞增殖、分化中的作用，作者用角质细胞生长因子对毛囊干细胞进行干预，探索角质细胞生长因子对毛囊干细胞促增殖、促分化是否通过Wnt信号引起的。本实验发现，在添加表皮细胞生长因子的K-SFM培养基里继续添加角质细胞生长因子, 可以促进毛囊干细胞的增殖。培养48 h前增殖效应不明显，当培养时间超过48 h时，浓度为10 μg/L的角质细胞生长因子还保留较强的增殖能力，DNA活性检测发现10 μg/L的角质细胞生长因子与对照组有明显差异。DNA活性减弱速度减缓，说明角质细胞生长因子可维持细胞增殖，在调节角质细胞终末分化的过程中起延缓其向终末细胞分化的作用。

Richardson等^[9]用老鼠培养胚胎皮肤的方法观察角质细胞生长因子和表皮细胞生长因子信号对毛囊诱导的阻遏作用，他们在小鼠实验发现，毛囊初始形成的时候是Wnt信号的作用，后期滤泡形成是Shh信号引起。正常情况下毛囊的形成是Wnt信号的激活且β-catenin的mRNA的富集，同时Shh信号的激活也使Glil的mRNA升高，胞核中的LEF1的水平初期呈现表达，24 h后升高。在角质细胞生长因子或表皮细胞生长因子作用下表皮细胞胞核中LEF1始终表达。他们认为是角质细胞生长因子和表皮细胞生长因子显著的抑制了毛囊形成的信号分子，包括关键的Wnt (LEF1，DKK4)、Shh和骨形态发生蛋白等，延迟毛囊干细胞分化的作用。近年来，Andreadis等^[10]利用体外皮肤等同物，证明了角质细胞生长因子可以显著促进接种于脱细胞真皮基质的表皮系细胞的增殖，并可诱导α5β1整合素的表达及延迟K10的表达。本实验也观察到，角质细胞生长因子的作用下前72 h毛囊干细胞有微弱的增殖效应，特别是在10 μg/L组。培养时间>72 h，细胞DNA活性检测结果说明角质细胞生长因子减缓细胞的凋亡。但高浓度的角质细胞生长因子却加速细胞的老化，这可能与细胞体外培养培养基中营养物质消耗过快有关。作者对细胞进行10 μg/L的角质细胞生长因子诱导后，观察了Wnt信号分子的动态表达变化，结果发现，随着毛囊干细胞分化的进行，β-catenin表达有微弱的增加，而GSK-3β水平在第7天时表达水平有所下降。然而LEF1的水平在初期就减少了。显示角质细胞生长因子的干预作用与GSK-3β对Wnt/β-catenin途径由活化状态逐步走向抑制的过程尚未明确，却提示角质细胞生长因子与LEF1呈负相关，在初始阶段便抑制毛囊分化抑制毛囊形成。结果说明角质细胞生长因子与Wnt通路存在直接的关联，能使通路中的LEF1水平降低，这与Richardson等^[9]得出的结果相一致。其调节机制中一些环节尚未明确，有待于进一步深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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